Экспериментальное исследование восстановления после мышечной травмы, вызванной нотексин индуцированным поражением, с помощью метода EPI® в мышиной модели.

Ferran Abat, Soraya-L Valles, Pablo-Eduardo Gelber, Fernando Polidori, Adrian Jorda, Sergio García-Herreros, Joan-Carles Monllau и Jose-Manuel Sanchez-Ibáñez

Tilda Publishing

Скачать PDF

Скачать оригинал

Скачать WORD

Предпосылки: Механизмы лечения мышечной травмы с применением метода EPI®, основанного на электростимуляции, описаны не были. Данное исследование определяет, способен ли метод EPI® снизить повреждение мышцы.

Методы: Двадцать четыре крысы были разделены на контрольную группу, нотексиновую группу (7 и 14 дней) и группу нотексин + EPI. В целях вызова мышечной травмы, нотексин был введен в четырехглавую мышцу левой конечности крыс. Провоспалительный интерлейкин 1-бета (IL1β) и фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α) были определены с помощью ИФА. Экспрессия гамма-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPAR-γ), фактора роста эндотелии сосудов (VEGF) и рецепторов фактора роста эндотелии сосудов (VEGF-R1) были определены с помощью вестерн-блоттинга.

Результаты: Уровни плазмы ФНО-α и IL1β в травмированных нотексином крысах продемонстрировали значительный рост по сравнению с контрольной группой. EPI® вызвал возвращение значений ФНО-α и IL1β к контрольным уровням. Экспрессия PPAR-γ ослабла в пораженных четырехглавых мышцах крыс. EPI® усилил экспрессию PPAR-γ, VEGF и VEGF-R1. EPI® понизил уровни плазмы провоспалительных ФНО-α и IL1β и повысил противовоспалительный PPAR-γ и ангиогенный факторы, а также экспрессию VEGF и VEGF-R1.

Выводы: Метод EPI® может воздействовать на медиаторы воспаления в поврежденной мышечной ткани и влияет на васкуляризацию в травмированной области. Данные результаты означают, что EPI® способен предоставить новую успешную терапию для лечения мышечных травм. Несмотря на то, что приведенное исследование на крысах может предоставлять обоснованный подход к оценке лечения методом EPI®, необходимы исследования, разработанные с целью определения воздействия лечения методом EPI® на человека.

Ключевые слова: EPI, метод, нотексин, мышца, травма

Исследование

Предпосылки

Травмы мягких тканей являются регулярными в спорте и имеют показатель заболеваемости около 30%. Чрезмерно консервативные подходы к их лечению конфликтуют с экономическими интересами пациентов и их способностью к участию в выбранной ими спортивной активности. Некоторые авторы предложили качественные и гистопатологические классификации мышечных травм, напрямую связанные с внешним видом поражения и его изменением с течением времени.

Воспалительный процесс является одним из наиболее важных элементов реакции иммунной системы на травму. Это объясняется тем, что биохимический механизм и передача сигнала постоянны и надежны, независимо от причин возникновения повреждения. Немышечные клетки, такие как лейкоциты, фагоциты, макрофаги, цитокины и факторы роста, играют немаловажную роль в воспалительном процессе с точки зрения восстановления и регенерации после травмы мышцы, а также в возникновении второстепенного повреждения в течение воспалительного процесса. Определенные вещества, такие как интерлейкин 1-бета (IL1β), выделяемые в мышечной травме, действуя как межклеточные посредники, запускают процесс воспаления и восстановления. Более того, фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-α) является важным медиатором воспалительной реакции после травмы, в то время как активация PPAR, противовоспалительного протеина, подавляет провоспалительные процессы. Как результат мышечной травмы, локализированная вазодилатация, вызываемая обоими механизмами, происходит через выделение гистаминов клетками, присутствующими в поврежденной области, и путем активации маршрута фактора роста эндотелии сосудов и оксида азота (VEGF-NO). VEGF это наиболее важный фактор роста капилляров в скелетной мышечной ткани, который необходим для капилляризации ткани и усиления капиллярного роста как реакции на различные механические стимуляторы.

Электрическая стимуляция может послужить интегратором для организации клеток в структурированные ткани во время заживления раны, развития и регенерации тканей. По причине того, что клетки обладают сигнальными системами, вызывающими электростимуляцию, считается, что экзогенное применение лечебных токов с целью заживления ранения также принесет эффект. Трудности заключаются в технических деталях, таких как типы электродов, параметры стимуляции, место стимуляции и непостоянность естественного сопротивления.

Метод EPI® это физиотерапевтический и медицинский метод с ультразвуковым наведением, который заключается в вызове локализованного лизиса в поврежденной и/или вырожденной ткани при помощи гальванического тока, передаваемого через акупунктурную иглу. Применение гальванического тока вызывает химическую реакцию диссоциации молекул хлорида натрия и воды. Результатом данного процесса служит формирование молекул гидроксида натрия, который вызывает разрушение поврежденной ткани и активирует восстановительную воспалительную реакцию. Применение метода EPI® может стимулировать воспалительную реакцию и содействовать заживлению раны в дегенерирующем надколенном сухожилии у крыс, и доказало свою эффективность в лечении хронической пателлярной тендинопатии.

На данный момент не существует опубликованных фундаментальных исследований, относящихся к влиянию применения данного лечения на травму мышечной ткани. Соответственно, целью данного исследования было определить, может ли возыметь положительный эффект применение EPI® терапии на поврежденную мышечную ткань. Был проведен эксперимент, заключающийся в EPI® лечении по прошествии 7 дней после вызванной нотексином травмы. Нотексин был охарактеризован в экспериментальных моделях воспаления как вызывающий некроз волокон скелетных мышц. Нотексин, пресинаптический фосфолипазный нейротоксин А2, выделенный из змеиного яда, вызывает воспалительное событие, связанное с энзиматической активностью и выделением метаболитов арахидоновой кислоты или с механизмом, относящимся к гидролизу фосфолипидов.

Экспериментальная гипотеза заключается в том, что применение терапии внутритканевым чрескожным электролизом после вызванного нотексином повреждения мышцы вызывает мышечные эффекты, которые могут содействовать восстановлению травмированной мышечной ткани.

Методы

Двадцать четыре крысы линии Спрег-Доули весом 250-300 г были разделены на 4 группы. С целью вызова мышечной травмы в четырехглавую мышцу левой конечности внутримышечно было введено 200 мкл нотексина в концентрации 10 мкг/мл, что вызвало полную дегенерацию мышцы. В качестве контроля, группе крыс (n = 6) было введено 200 мкл солевого раствора. По истечении 7 дней крысы были усыплены, и были взяты пробы с целью определения эффектов вызванной нотексином мышечной травмы. Для изучения влияния EPI® лечения повреждения ткани было использовано специальное утвержденное устройство EPI® (EPI Advanced Medicine,

Барселона, Испания). Был приведен в действие следующий протокол: на седьмой день после вызванной нотексином мышечной травмы одна группа крыс (n = 6) была подвергнута лечению с помощью EPI®. Данное лечение заключается в приложении к мышце 4 импульсов постоянного тока силой 3 мА в течении 5 секунд. Акупунктурная игла диаметром 0.32 мм была использована в качестве электрода. Чтобы изучить, как прогрессирует травма в отсутствии EPI® лечения, другая группа крыс (n = 6) была сохранена в течении 14 дней после вызванной нотексином травмы. Перед применением каждого лечения, крысы были анестезированы внутрибрюшинно пентобарбиталом натрия (90 мг/кг). Развитие повреждения мышечной ткани было оценено при помощи эхографии. Идентичные оценки были проведены по прошествии семи дней после EPI® лечения. После исполнения протокола, крысы были усыплены, мышечная ткань была удалена из обрабатываемой области и пробы были проанализированы с использованием вестерн-блоттинга. В дополнение к этому, были собраны пробы крови с целью определения уровней плазмы цитокинов ФНО-α и IL1β с помощью ИФА. Исследование было утверждено этическим комитетом Медицинского Университета Валенсии, Испания (A1301314899794). Все операции над животными были проведены в соответствии с европейскими законами о содержании и использовании лабораторных животных (CEE 86/609).

До и после EPI® лечения была проведена ультразвуковая эхография для отслеживания состояния мышечной травмы, вызванной нотексином (Рис. 1). Данное обследование было выполнено в соответствии с вышеописанным протоколом.

Уровни плазмы цитокинов IL1β и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) были определены с помощью ИФА-систем (Thermo Scientific Laboratories, Рокфорд, США), следуя рекомендациям производителя.

Мышечные ткани были гомогенизированы в лизисном буфере из (в мМ) 50 Tris-HCl, 125 NaCl, 1 EDTA, 1 EGTA и 1% Nonidet (NP-40, содержащий 5% коктейль ингибиторов протеаз Complete Mini-tab (Roche Biochemicals)). Затем они были помещены в центрифугу при 10000 об/м на 15 минут при 4°C. Концентрация протеина была определена с использованием метода Lowry. Протеин был растворен в 12% SDS-PAGE и перемещен электрофорезом на PVDF-мембрану, используя ячейку Mini Trans-Blot (BioRad laboratories, Калифорния). Мембраны были размещены блоками в 5% обезжиренное молоко на 1 час при комнатной температуре, и затем инкубированы с использованием соответствующих антител, руководствуясь рекомендациям производителя. После промывания, мембраны были инкубированы с помощью вторичных антител конъюгата пероксидазы хрена (Sigma Aldrich). Затем метки были визуализированны, используя InmunostarTM HRP Substrate Kit (BioRad), опять же, в соответствии с инструкциями производителя. Относительные плотности полос были проанализированы в Image Gauge v4.0, Fujifilm. Протеины были нормализованы тубулином. Были использованы моноклональные антитела против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (1:500), антитела против рецепторов 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-R1) (1:500) , антитела против PPAR-γ (1:500) и антитубулин.

Рис. 1. Сравнение исходной ткани (A), мышечной ткани через 21 день после нанесения травмы нотексином (B) и результат применения EPI® через 7 дней после повреждения (C) на изображениях эхографии. Можно обнаружить зону разрушения в серединной области четырехглавой мышцы конечности крысы на 21 день повреждения (обведенная область), сравнивая с нормальной тканью той же области (B). Изображение (C) показывает зону меньшего разрушения той же области мышцы, обработанной методом EPI® через 21 день после нанесения повреждения (обведенная область).

Для статистического анализа, данные были представлены в формате среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. Дисперсионный анализ (ANOVA factor) был применен с целью анализа отношений внутри и между переменными. Тесты Post-Hoc и Dunnett также были проведены для сравнения различных групп и контрольной группой, и тест Scheffe был использован для сравнения всех групп. Значимым считалось P-значение меньше 0.05.

Результаты

Нотексин вызвал повреждение ткани, характеризующееся безэховым ультразвуковым изображением и скоплением жидкости, присущим поражению мышц (Рис. 2А). Лечение с применением EPI® вызвало рассасывание жидкости и восстановление без утолщения рубцовой ткани (Рис. 2B).

Рис. 2. Продольное ультразвуковое изображение левой четырехглавой мышцы конечности крысы. Через 7 дней после применения нотексина (А), безэховое изображение со скоплением жидкости (стрелка) указывает, что наблюдается разрушение мышцы. После EPI® лечения (B) можно увидеть полное рассасывание гематомы и восстановление мышцы (стрелка).

Уровни провоспалительных факторов ФНО-α и IL1β у травмированных нотексином крыс показали значительное возрастание (p < 0.05) концентрации плазмы по сравнению с контрольными значениями. В дополнение к этому, было обнаружено значительное снижение концентрации ФНО-α и IL1β, когда были сопоставлены группа нотексин + EPI и нотексиновая группа. Так, применение EPI® лечения после нотексина спровоцировало падение ФНО-α и IL1β до контрольных уровней. По прошествии 14 дней после воздействия нотексином без применения EPI®, значения цитокинов продолжили возрастать (Рис. 3A и B). Данные результаты исключили самопроизвольное восстановление повреждения мышц.

Рис. 3. Уровни плазмы IL1β (A) и ФНО-α (B) в контрольной (C), нотексиновой (N7d, N14d) и нотексин + EPI (N+E) группах. Значения были получены путем иммуноферментного анализа, как было описано в разделе методов. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение шести независимых экспериментов. * p < 0.05 против контрольной группы; # p < 0.05 против обеих нотексиновых групп.

Подобным образом, вызванная нотексином травма понижает значения экспрессии PPAR-γ (p < 0.05) в четырехглавых мышцах крыс. Применение EPI® усилило экспрессию PPAR-γ и вернуло её к контрольным значениям, показав, что применение EPI® лечения вызывает восстановление противовоспалительного протеина PPAR-γ (Рис. 4). Более того, через 14 дней после воздействия нотексином без применения EPI® экспрессия протеина PPAR-γ осталась пониженной, тем самым показав, что повышение экспрессии протеина PPAR-γ не самопроизвольно, но является последствием EPI® лечения.

Воздействие нотексином (после 7 и 14 дней) вызвало повышение экспрессии протеинов VEGF и VEGF-R1 по сравнению с контрольным уровнем (p < 0.05). Кроме того, EPI® значительно потенцировал повышение экспресии VEGF и VEGF-R1, вызванное нотексином (Рис. 5).

Никакие неблагоприятные события во время исследования предоставлены не были.

Рис. 4. Экспрессия протеина PPAR-γ (относительные денситометрические единицы) в контрольной (C), нотексиновой (N7d, N14d) и нотексин + EPI (N+E) группах. Значения были получены в левой четырехглавой мышце конечности крысы вестерн-блоттингом. Приведен образец иммуноблота, тубулин был использован в качестве контрольного количества протеина. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение шести независимых экспериментов. * p < 0.05 против контрольной группы; # p < 0.05 против обеих нотексиновых групп.

Рис. 5. Анализ протеинов VEGF и VEGF-R1. Экспрессия протеинов VEGF (A) и VEGF-R1 (B) в контрольной (C), нотексиновой (N7d, N14d) и нотексин + EPI (N+E) группах были определены вестерн-блоттингом. Значения получены в левой четырехглавой мышце конечности крысы. В каждой панели показан образец иммуноблота и тубулин в качестве контрольного количества протеина. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение шести независимых экспериментов. * p < 0.05 против контрольной группы; # p < 0.05 против обеих нотексиновых групп.

Обсуждение

Основные выводы данного исследования заключаются в том, что применение EPI® после вызванной нотексином мышечной травмы у крыс снижает выработку провоспалительных медиаторов ФНО-α и IL1β и повышает протеиновую экспрессию противовоспалительного фактора PPAR-γ и участвующих в ангиогенезе протеинов VEGF и VEGF-R1.

Повышение уровней плазмы ФНО-α было зафиксировано во время первых дней после тканевой травмы и сохранилось на повышенном уровне по причине её воздействия на клеточный некроз. ФНО-α прерывает процесс дифференцировки и способен стимулировать катаболизм, тем самым ускоряя деградацию протеина. Более того, ФНО-α препятствует миогенезу редокс-зависимыми и независимыми способами. Один из потенциальных механизмов, которым ФНО-α может напрямую стимулировать катаболизм, заключается в препятствии дифференцировки миобластов – события, которое способно ограничить регенеративную реакцию спутниковых клеток на мышечную травму. Другой механизм, апоптоз, предоставляется менее значимым. Третий механизм заключается в прямом воздействии на мышечную ткань. Во время культивирования мышечных клеток, ФНО-α напрямую снижает общий мышечный белок и утрату протеинов мускулатуры, включая тяжелую цепь миозина быстрого типа.

Приведенные данные показывают возрастание уровней плазмы ФНО-α по причине вызванной нотексином травмы. EPI® лечение нормализует уровни ФНО-α до достижения значений контрольной группы. Напротив, в группе крыс, не прошедших EPI® лечение, уровни ФНО-α остались повышенными по сравнению с контрольной группой через 14 дней после применения.

Действие ФНО-α также чувствительно к другим взаимодействиям с рецепторами/лигандами (например, с интерлейкином 1 и интерлейкином 6). Нотексин вызвал значительное возрастание IL1β по сравнению с контрольной группой. Поддержание IL1β с течением времени было более обусловлено его ролью как провоспалительного цитокина, чем его воздействием на некроз ткани. Более того, IL1β вызывает торможение синтеза протеина в скелетной мышце. EPI® лечение возвращает уровни плазмы IL1β к нормальным значениям. Напротив, через 14 дней без EPI® уровни IL1β остаются высокими по сравнению с контрольными значениями. В совокупности, результаты показывают, что применение EPI® эффективно в ослаблении провоспалительных медиаторов. Для определения механизмов, участвующих в воспалительных эффектах EPI® лечения, необходимы дальнейшие исследования. Кроме того, EPI® ослабляет провоспалительные медиаторы, а также возможна активация противовоспалительных протеинов. Было выяснено, что PPAR-γ играет основополагающую роль в иммунной реакции вследствие его способности снижать экспрессию провоспалительных генов. Он также повышает уровни экспрессии генов, которые участвуют в противовоспалительных эффектах и восстановлении тканей. Кроме того, PPAR-γ вызывает экспрессию VEGF и его рецепторов в культивированных кардиальных миофибробластах. Приведенные данные показывают, что нотексин послужил причиной значительного снижения экспрессии протеина PPAR-γ, на схожем уровне через 7 и 14 дней, по сравнению с контрольными значениями. EPI® лечение значительно повышает экспрессию протеина PPAR-γ, сниженную нотексином, и возвращает уровни к контрольным значениям. В дополнение к этому, PPAR-γ способствует накоплению энергии в мышечных клетках путем увеличения потребления жирных кислот и эстерификации, в то же время усиливая инсулиновую сигнализацию и формирование гликогена, что положительно влияет на метаболическое здоровье и, следовательно, на восстановление тканей.

Электрическая стимуляция воздействует множеством способов на управление делением клеток, сосудистые эндотелиальные клетки, ангиогенез и миграцию эндотелиальных клеток, каждый из которых является важным элементом в заживлении повреждений. Фактор роста эндотелии сосудов (VEGF) – это паракринный фактор. Его важнейшая функция заключается в содействии ангиогенезу путем повышения выживаемости клеток, индуцируя пролиферацию и усиливая миграцию и инвазию эндотелиальных клеток. Волокна скелетных мышц могут контролировать капиллярный рост путем производства VEGF из внутриклеточных везикул по время сокращения. Недавние исследования показывают, что VEGF влияет на регенерацию скелетных мышц путем стимулирования миогенной дифференцировки мышечных стволовых клеток.

Приведенные результаты указывают на явную стимуляцию экспрессии протеина VEGF после вызванного нотексином повреждения. Данные результаты соответствуют повышенному производству VEGF в поврежденной ткани по сравнению с нормальной тканью. Более того, VEGF-R1, наиболее активно индуцированный тканевой травмой рецептор, также повышается, как было описано у травмированных пациентов. Кроме того, EPI® лечение значительно повышает и VEGF, и VEGF-R1, что говорит о его активной роли в поддержании микроциркуляции крови, и способно повысить системный уровень растворимых противовоспалительных и цитопротекторных медиаторов, что может способствовать восстановлению после травмы.

Несмотря на многочисленные предложенные способы лечения мышечных травм, вероятность повторного возникновения травмы все еще высока. Причиной этого, возможно, является тот факт, что требуется более глубокое понимание и анализ типа, размера и расположения поражения в каждом конкретном случае.

Некоторые авторы аргументируют, что размер поражения коррелирует с продолжительностью отстранения пациента от соревнований. Напротив, другие группы исследований предполагают, что ни наличие ультразвуковых признаков, ни их размер не коррелируют со временем отстранения от соревнований. Таким образом, прогноз исхода мышечной травмы не должен быть основан исключительно на приведенных результатах.

Несмотря на то, что количество прецедентов можно посчитать низким, различие между исследованными переменными оказалось очень высоким. Таким образом, была достигнута достаточная статистическая мощность для обнаружения различий со значимостью в диапазоне от 55% до 58% для переменных VEGF и VEGF-R1, а также от 88% до 100% для переменных ФНО и IL1β.

Исследование имеет некоторые недостатки, например, использование крыс. По существу, результаты может быть невозможно экстраполировать на людей. Несмотря на такую вероятность, крысы были использованы во многих достоверных экспериментальных исследованиях. Другим недостатком является отсутствие гистологических и функциональных оценок, которые могли бы наделить интерпретацию предоставленных данных физиологической актуальностью. Электролиз и/или гидроксид натрия, производимый методом EPI®, могут повлиять на значения IL1β и ФНО-α, что затронет существующие цитокины. По этой причине мы ожидаем 7 дней после применения метода EPI® для оценки его положительных эффектов. Цитокины из клеток в окрестности будут производиться хронически и поддерживаться с течением времени в присутствии воспаления и повреждения. Мы наблюдаем сокращение провоспалительных цитокинов после применения EPI®. Таким образом, возможно, что клетки находятся в состоянии меньшего воспаления и меньшего производства цитокинов по сравнению с клетками, не подвергнутыми EPI®.

Несмотря на выявленные недостатки, настоящая работа является первым исследованием эффектов EPI® на мышечную ткань, которое показывает биомолекулярные механизмы, запущенные его применением. Эта экспериментальная работа является основой, на которой должны быть разработаны клинические испытания для подтверждения эффективности применения EPI® на людях.

Заключение

Применение EPI® на мышцах крыс, предварительно травмированных нотексином, вызывает значительное снижение провоспалительных медиаторов, таких как ФНО-α, а также уровней IL1β. С другой стороны, применение EPI® вызывает повышение экспрессии противовоспалительных протеинов (PPAR-γ) и также повышает экспрессию VEGF и VEGF-R1. Следовательно, использование EPI® может воздействовать на воспалительные медиаторы в поврежденной мышечной ткани и влиять на новую васкуляризацию травмированной области. Данные результаты означают, что EPI® способен предоставить новую терапию, пригодную для лечения мышечных травм.

Несмотря на то, что данное исследование на крысах может предоставить обоснованный подход к оценке EPI® лечения, необходимы исследования, разработанные с целью определения влияния EPI® лечения на восстановление после травмы у человека.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что один из авторов (SIJM) имеет патент на устройства EPI®. Этот автор принимал участие в процессе интервенции, но не в сборе данных и/или анализе данного исследования. Все авторы привнесли существенный вклад в концепцию и проектирование исследования, сбор данных, анализ и интерпретацию данных, написание статьи, её критическую рецензию с целью получения важного интеллектуального содержания и окончательное одобрение опубликованной версии. Никакого финансирования на данное исследование получено не было.

Вклад авторов

AF, SLV, SIJM, PEG и MJC выдвинули идею исследования, и приняли участие в её разработке, согласовании и написании текста. AF, SLV, SIJM и GHS провели иммуноанализ и помогли в написании текста. PF, JA, SLV и GHS провели молекулярные исследования и помогли в написании текста. Все авторы прочли и одобрили конечную статью.

Благодарности

Мы признательны E. Goode за его помощь в редактировании статьи. Мы также благодарим G. Gich за содействие в статистическом анализе.

Ссылки

1. Ekstrand J, Hägglund M, Waldén M. Epidemiology of muscle injuries in professional football (soccer). Am J Sports Med. 2011;39(6):1226–32.

2. Verrall GM, Slavotinek JP, Barnes PG. The effect of sports specific training on reducing the incidence of hamstring injuries in professional Australian rules football players. Br J Sports Med. 2005;39(6):363–8.

3. Li Y, Foster W, Deasy BM, Chan Y, Prisk V, Tang Y, et al. Transforming growth factor-beta1 induces the differentiation of myogenic cells into fibrotic cells in injured skeletal muscle: a key event in muscle fibrogenesis. Am J Pathol. 2004;164(3):1007–19.

4. Tidball JG. Inflammatory processes in muscle injury and repair. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005;288(2):R345–53.

5. Moresi V, Pristerà A, Scicchitano BM, Molinaro M, Teodori L, Sassoon D, et al. Tumor necrosis factor-alpha inhibition of skeletal muscle regeneration is mediated by a caspase-dependent stem cell response. Stem Cells. 2008;26(4):997–1008.

6. Liu CS, Chang CC, Du YC, Chang FR, Wu YC, Chang WC, et al. 2-hydroxy-4′-methoxychalcone inhibits proliferation and inflammation of human aortic smooth muscle cells by increasing the expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. J Cardiovasc Pharmacol. 2012;59(4):339–51.

7. Thom R, Rowe GC, Jang C, Safdar A, Arany Z. Hypoxic induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiogenesis in muscle by truncated peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator (PGC)-1α. J Biol Chem. 2014;289(13):8810–7.

8. Hudlicka O, Brown MD. Adaptation of skeletal muscle microvasculature to increased or decreased blood flow: role of shear stress, nitric oxide and vascular endothelial growth factor. J Vasc Res. 2009;46(5):504–12.

9. Olfert IM, Howlett RA, Wagner PD, Breen EC. Myocyte vascular endothelial growth factor is required for exercise-induced skeletal muscle angiogenesis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2010;299(4):R1059–67.

10. Zhao M. Electrical fields in wound healing-An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 2009;20(6):674–82.

11. Abat F, Valles SL, Gelber PE, Polidori F, Stitik TP, García-Herreros S, et al. Molecular repair mechanisms using the Intratissue Percutaneous Electrolysis technique in patellar tendonitis. Rev Esp Cir Ortop Traumatol. 2014;58(4):201–5.

12. Abat F, Gelber PE, Polidori F, Monllau JC, Sanchez-Ibañez JM. Clinical results after ultrasound-guided intratissue percutaneous electrolysis (EPI®) and eccentric exercise in the treatment of patellar tendinopathy. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2014;23(4):1046–52. Abat et al. BMC Sports Science, Medicine, and Rehabilitation (2015) 7:7 Page 6 of 7

13. Abat F, Diesel WJ, Gelber PE, Polidori F, Monllau JC, Sanchez-Ibañez JM. Effectiveness of the Intratissue Percutaneous Electrolysis (EPI®) technique and isoinertial eccentric exercise in the treatment of patellar tendinopathy at two years follow-up. Muscles Ligaments Tendons J. 2014;4(2):188–93.

14. Head SI, Houweling PJ, Chan S, Chen G, Hardeman EC. Properties of regenerated mouse extensor digitorum longus muscle following notexin injury. Exp Physiol. 2014;99(4):664–74.

15. Joensen J, Gjerdet NR, Hummelsund S, Iversen V, Lopes-Martins RA, Bjordal JM. An experimental study of low-level laser therapy in rat Achilles tendon injury. Lasers Med Sci. 2012;27(1):103–11.

16. Meador BM, Krzyszton CP, Johnson RW, Huey KA. Effects of IL-10 and age on IL-6, IL-1beta, and TNF-alpha responses in mouse skeletal and cardiac muscle to an acute inflammatory insult. J Appl Physiol. 2008;104(4):991–7.

17. Crassous B, Richard-Bulteau H, Deldicque L, Serrurier B, Pasdeloup M, Francaux M, et al. Lack of effects of creatine on the regeneration of soleus muscle after injury in rats. Med Sci Sports Exerc. 2009;41(9):1761–9.

18. Bhatnagar S, Panguluri SK, Gupta SK, Dahiya S, Lundy RF, Kumar A. Tumor necrosis factor-α regulates distinct molecular pathways and gene networks in cultured skeletal muscle cells. PLoS One. 2010;12;5(10):e13262.

19. Langen RC, Schols AM, Kelders MC, Van Der Velden JL, Wouters EF, Janssen-Heininger YM. Tumor necrosis factor-alpha inhibits myogenesis through redox-dependent and -independent pathways. Am J Physiol Cell Physiol. 2002;283(3):C714–21.

20. Borghi SM, Zarpelon AC, Pinho-Ribeiro FA, Cardoso RD, Cunha TM, Alves-Filho JC, et al. Targeting interleukin-1β reduces intense acute swimming-induced muscle mechanical hyperalgesia in mice. J Pharm Pharmacol. 2014;66(7):1009–20.

21. Bertin B, Dubuquoy L, Colombel JF, Desreumaux P. PPAR-gamma in ulcerative colitis: a novel target for intervention. Curr Drug Targets. 2013;14(12):1501–7.

22. von Knethen A, Neb H, Morbitzer V, Schmidt MV, Kuhn AM, Kuchler L, et al. PPARγ stabilizes HO-1 mRNA in monocytes/macrophages which affects IFN-β expression. Free Radic Biol Med. 2011;51(2):396–405.

23. Lea S, Plumb J, Metcalfe H, Spicer D, Woodman P, Fox JC, et al. The effect of peroxisome proliferator-activated receptor-γ ligands on in vitro and in vivo models of COPD. Eur Respir J. 2014;43(2):409–20.

24. Chintalgattu V, Harris GS, Akula SM, Katwa LC. PPAR-gamma agonists induce the expression of VEGF and its receptors in cultured cardiac myofibroblasts. Cardiovasc Res. 2007;74(1):140–50.

25. Hu S, Yao J, Howe AA, Menke BM, Sivitz WI, Spector AA, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor γ decouples fatty acid uptake from lipid inhibition of insulin signaling in skeletal muscle. Mol Endocrinol. 2012;26(6):977–88.

26. Hoier B, Prats C, Qvortrup K, Pilegaard H, Bangsbo J, Hellsten Y. Subcellular localization and mechanism of secretion of vascular endothelial growth factor in human skeletal muscle. FASEB J. 2013;27(9):3496–504.

27. Bouchentouf M, Benabdallah BF, Bigey P, Yau TM, Scherman D, Tremblay JP. Vascular endothelial growth factor reduced hypoxia-induced death of human myoblasts and improved their engraftment in mouse muscles. Gene Ther. 2008;15(6):404–14.

28. Beckman SA, Chen WC, Tang Y, Proto JD, Mlakar L, Wang B, et al. Beneficial effect of mechanical stimulation on the regenerative potential of muscle-derived stem cells is lost by inhibiting vascular endothelial growth factor. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013;33(8):2004–12.

29. Rignault-Clerc S, Bielmann C, Delodder F, Raffoul W, Waeber B, Liaudet L, et al. Functional late outgrowth endotelial progenitors isolated from peripheral blood of burned patients. Burns. 2013;39(4):694–704.

30. Ostrowski SR, Sørensen AM, Windeløv NA, Perner A, Welling KL, Wanscher M, et al. High levels of soluble VEGF receptor 1 early after trauma are associated with shock, sympathoadrenal activation, glycocalyx degradation and inflammation in severely injured patients: a prospective study. Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2012;10:20–7.

31. Askling CM, Tengvar M, Tarassova O, Thorstensson A. Acute hamstring injuries in Swedish elite sprinters and jumpers: a prospective randomized controlled clinical trial comparing two rehabilitation protocols. Br J Sports Med. 2014;48(7):532–9.

32. Connell DA, Schneider-Kolsky ME, Hoving JL, Malara F, Buchbinder R, Koulouris G, et al. Longitudinal study comparing sonographic and MRI assessments of acute and healing hamstring injuries. AJR Am J Roentgenol. 2004;183(4):975–84.

33. Petersen J, Thorborg K, Nielsen MB, Skjødt T, Bolvig L, Bang N, et al. The diagnostic and prognostic value of ultrasonography in soccer players with acute hamstring injuries. Am J Sports Med. 2014;42(2):399–404.

34. Prior M, Guerin M, Grimmer K. An evidence-based approach to hamstring strain injury: a systematic review of the literature. Sports Health. 2009;1(2):154–64.

35. Delos D, Leineweber MJ, Chaudhury S, Alzoobaee S, Gao Y, Rodeo SA. The effect of platelet-rich plasma on muscle contusion healing in a rat model. Am J Sports Med. 2014;42(9):2067–74.