L- карнитин: воздействие на окислительный процесс тканей, регенерацию клеток и экспрессию белков костной ткани.

Источник https://doi.org/10.1155/2019/5678548

BioMed Research International Volume 2019, Article ID 5678548, 13 pages Дата публикации 20 января 2019 г.

Авторы Ileana Terruzzi, Anna Montesano, Pamela Senesi, Isabella Villa, Anita Ferraretto, Michela Bottani, Fernanda Vacante, Alice Spinello, Simona Bolamperti, Livio Luzi, and Alessandro Rubinacci.

Department of Biomedical Sciences for Health, Università degli Studi di Milano, Via Luigi Mangiagalli, 31, 20133 Milano, Italy

Metabolism Research Center, IRCCS Policlinico San Donato, Piazza Edmondo Malan, 2, 20097 San Donato Milanese, Italy

Bone Metabolism Unit, San Raffaele Scientific Institute, Via Olgettina 60, 20132 Milano, Italy

IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, Laboratory of Experimental Biochemistry & Molecular Biology, Via Riccardo Galeazzi 4, 20161 Milano, Italy

Аннотация

Хрупкость костей и связанный с ними риск переломов являются основными проблемами
старения. Окислительный стресс и митохондриальная дисфункция играют ключевую роль в развитии ломкости костей. Митохондриальная дисфункция тесно связана с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК). L-карнитин (LC), основной фактор липидного обмена, обладает важным антиоксидантным свойством.

В текущем исследовании мы изучали потенциальное влияние LC на митохондриальную активность,
продукцию ROS и экспрессию генов, участвующих в дифференцировке остеобластов с использованием остеобластоподобных клеток (hOBs), полученных от пожилых пациентов. Мы выяснили, что LC может представлять собой средство в лечении хрупкости костей путем противодействия окислительным явлениям и поддержания качества костной ткани.

Введение в суть исследования

Во многих исследованиях признается ключевая роль активности митохондрий в обеспечении эффективности клеточных метаболических функций, таких как производство аденозинтрифосфата (АТФ). С помощью окислительного фосфорилирования и переноса электронов (ETC) происходит гомеостаз кальция, генерация активных форм кислорода (ROS) и регуляция клеточного апоптоза. Чрезмерное увеличение АФК может привести к повреждению ДНК и дисфункции митохондрий, способствуя развитию различных патологий. Дальнейшее повреждение остеобластов и заболевания костей при старении приводят к стрессовому количество окислительных связей, что ухудшает качество костей.

Использование нутриентов, как L-карнитин (LC), позволяет получить следующие преимущества:

1. Стимулирует функции остеобластов человека и внутриклеточную передачу сигналов кальция.
2. Оказывает непосредственное влияние на остеобласт человека путем значительного увеличения
активности и пролиферации остеобластов, а также экспрессии коллагена типа I, сиалопротеинов кости (BSPs) и остеопонтина (OPN).
3. Л-карнитин может предотвращать окислительный стресс, противодействовать митохондриальной дисфункции и ускорять дифференцировку миобластов C2C12, вызывая образование миотрубок и гипертрофию.

Мы провели следующее исследование с целью охарактеризовать влияние LC на остеобласты, полученные из трабекулярной кости человека (hOB). Учитывая интерес к нутрицевтикам в качестве возможных адъювантов в современных методах лечения остеопороза, это исследование может помочь в характеристике молекулярных механизмов, лежащих в основе положительного воздействия LC на костные клетки, поддерживая тем самым благоприятные эффекты LC при лечении ломкости костей у пожилых людей.

Материалы и методы исследования

Все реагенты и носители были приобретены американских и европейских производителей, имеющих сертификацию на продукт и обладающих хорошей репутацией среди потребителей. фрагменты остеобластов человека были получены из тканей пациентов во время ортопедической операции при дегенеративных заболеваниях или травматических переломах шейки бедра, требующих остеотомии. Изученные эффекты не зависели от возраста доноров. Изучение проходило в несколько этапов:

1. Трабекулярную кость разрезали на мелкие кусочки, промыли и инкубировали с вращением при 37° С в течение 30 мин с 0,5 мг/мл коллагеназы типа IV.
2. Затем кусочки кости были помещены в колбу и культивированы в модифицированной среде Искова (IMDM), содержащей 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина, 100 г/мл стрептомицина, 50 ед/мл
микостатина и 0,25 г/мл амфотерицина типа В до слияния.
3. После 24 часов нахождения в сыворотке hOb кости обрабатывали в течение различного времени (1, 3 и 6 ч) LC (5 мМ).
4. Общая РНК из слитых hOBs была экстрагирована с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя.
5. Экспрессию мРНК остеогенных генов RUNX2, остерикса (OSX), белка костей-сиало (BSP), остеопонтина (OPN) и остеокальцина (BGP) оценивали с помощью ПЦР в реальном времени с использованием наборов праймеров-зондов.
Каждую экспериментальную точку анализировали в трех проекциях, эксперименты проводили несколько раз с клетками, полученными от разных доноров.
6. Через 24 часа в бессывороточной среде слившиеся hOb стимулировали LC (5 мМ) в течение 5, 15 и 60 минут и в течение 6 часов и 24 часов.
7. После этого клетки hOBs лизировали буфером RIPA, дополненным ингибиторами протеаз и
фосфатаз. Результаты затем были преобразованы в кратное изменение (FC) контроля.
8. После голодания hOb в течение 24 часов клетки обрабатывали в течение 3, 6 и 24 часов LC (5 мМ). hOb, инкубировали в PBS с 1% BSA, чтобы избежать неспецифического связывания антител.
9. Затем клетки инкубировали со специфическими антителами, конъюгированными с FITC или
родамином.
10. Антиоксидантную активность LC в hOBs оценивали с помощью анализа антиоксидантной активности (CAA) на клеточном уровне. Результаты показаны как среднее значение ± SD или ± SEM.

Чтобы оценить влияние LC на митохондриальную активность, hOB обрабатывали LC (5 мМ) в течение 24 часов, 48 часов и 72 часов. Анализ CytoPainter показал, что LC увеличивает интенсивность сигнала, связанного с активными митохондриями, через 24, 48 и 72 часа лечения, достигая значимости (p <0,05) через 72 часа (рисунок 1). Способность LC модулировать митохондриальную активность у hOBs предполагает, что LC может поддерживать антиоксидантную активность остеобластов.

Рисунок 1

Дополнительные результаты исследования

L-карнитин снижает окислительный стресс и повышает антиоксидантную защиту у детей. Чтобы оценить возможную антиоксидантную активность LC у hOBs, мы провели клеточный антиоксидантный анализ (CAA). Результаты показали статистически значимый антиоксидантный эффект LC по сравнению с контролем (значение CAA = 97 ± 3, р <0,01).
Учитывая основную роль супероксиддисмутазы 2 (SOD2) в ограничении продукции АФК в условиях окислительного стресса в митохондриях, мы оценили влияние LC на SOD2. LC индуцировал значительное увеличение содержания белка SOD2 после 6-часовой и 24-часовой обработки по сравнению с контролем (p <0,001) (рисунок 2).
LC модулирует передачу сигналов кальция у hOBs, мы проанализировали влияние LC на передачу сигналов Ca 2+, изучая активацию кальций-зависимого фермента Ca 2+. ЛК удалось значительно увеличить фосфорилирование CaMKII α через 5 и 15 мин лечения (р <0,05). LC значительно увеличивает содержание белка в общем CaMKII через 6 часов (p <0,05) по сравнению с контролем (рисунок 3).
LC индуцировал значительное увеличение фосфорилирования как ERK1 (p <0,05), так и ERK2 (p <0,01) после 15 мин обработки по сравнению с контролем, как указано соотношениями pERK1/ERK1 и pERK2/ERK2 (рисунок 4).
Обработка LC стимулировала экспрессию мРНК RUNX2 и OSX, двух основных факторов транскрипции, которые модулируют синтез специфических для остеобластов белков (рисунок 5). Иммунофлуоресцентное окрашивание и вестерн-блоттинг показали, что белок OPN увеличивался через 6 ч (р <0,05) и через 24 ч (р <0,001) после обработки LC (рисунок 6).
Чтобы исследовать роль передачи сигналов ERK в наблюдаемом увеличении экспрессии остеогенных генов после обработки LC, мы использовали FR180204 - селективный ингибитор активности ERK1 и ERK2. Предварительная обработка с помощью 10 μ М FR180204 в течение 30 мин до 5 мМ LC предотвратила увеличение Runx2 и экспрессию OPN с помощью LC (рисунок 7).

Рисунок 2

Рисунок 3

Рисунок 4

Рисунок 5

Рисунок 6

Рисунок 7

----------------

Дисклеймер отказа от ответственности: ORO Sport не несёт ответственность за достоверность указанных в материале данных и не несет ответственности за последствия или ущерб от использования текстов, документов, изображений или другой информации.

Поделитесь материалом с тем, кому это может быть полезно!

Обложка статьи: https://www.pixabay.com/